聚合酶鏈反應（PCR）是一種很普及的技術，廣泛應用于臨床診斷和分子生物學研究。 PCR是由DNA聚合酶在體外擴增特定的核酸（NA）序列。PCR技術的飛躍發生在1983年，當Kary Mullis推廣使用了伴隨溫度循環的熱穩定聚合酶 [1] [2] [3] 。PCR的普遍應用在于其能把數量很少的靶核酸序列，擴增成大量的PCR產物，然后通過下游方法檢測，例如通過瓊脂糖凝膠電泳觀察核酸（NA）產物。這是由于核酸（NA）序列的指數擴增，使得起始模板（靶核酸序列）擴增產生數百萬的拷貝。

PCR反應擴增靶核酸序列是通過使用DNA聚合酶，引物和核苷酸。 PCR反應的模板可能是任何靶核酸序列，核酸的來源可能是DNA，RNA或cDNA。引物是體外合成的核酸短序列。引物的設計是互補結合于特定靶核酸模板的反義鏈，引物的長度通常是15-40個堿基。引物*好是缺少二級結構并且不彼此互補，以防止引物二聚體的形成。多種DNA聚合酶都可用于PCR，但*廣泛使用的是耐熱的Taq DNA聚合酶。這種酶根據模板的核酸序列進行引物延伸（在引物末端添加dNTPs或核苷酸）。

PCR反應通常是20-40個溫度循環。核酸模板序列的變性是在95℃進行的。引物退火結合與靶序列是在溫度冷卻至37-60℃進行的。引物的核苷酸延伸是DNA聚合酶在60-72℃的范圍內進行的。常規的循環條件是起初95℃持續5分鐘，使得所有的核酸模板變性，接著是重復2-40個溫度循環（95℃持續30秒，60℃持續30秒，72℃持續1分鐘）。對于具體試驗，在每個溫度上持續的時間可以優化。例如，很短的靶序列的擴增相比于很長的靶序列，在每個溫度上需要持續的時間就要短得多。每個溫度循環獲得的靶序列產物都是前一個循環的產物的2倍。這就導致了原始模板的指數擴增，通常獲得的產物是原始靶核酸序列的數百萬或數十億的拷貝。

基本PCR反應有三個時期。指數時期是每個溫度循環擴增的核酸產物都是確切倍增。實時PCR檢測就是在指數時期進行的。線性時期發生的反應減慢是由于試劑的消耗和產物的降解。*后時期是平臺期，就是反應停止，不再生成擴增產物了。常規PCR反應就是在平臺期通過凝膠電泳分析PCR反應產物。

圖 1. PCR反應的時期. 在PCR反應過程中，在指數時期發生的是產物的倍增，在線性時期發生的是略低于倍增的產物擴增，在平臺期發生的是非常低的幾乎停滯的產物擴增。

PCR產物的下游檢測有許多種方法。一種常用的觀察方法是通過瓊脂糖凝膠電泳。這包括通過電泳分離核酸片段，使用嵌入染料如溴化乙錠或SybrSafe染色核酸片段，隨后使用紫外線光源和成像系統檢測（圖2）。

圖 2. DNA的瓊脂糖凝膠的照片. *左邊的一行是DNA梯狀條帶，包含已知大小的核酸片段。凝膠上*下面的條帶是長度為100個堿基對的核酸片段。右面的幾行是長度為120個堿基對的PCR擴增產物。

實時PCR使用專門的熱循環儀檢測每個反應孔的熒光信號。這個信號指示的是反應管或反應孔所含的雙鏈核酸的量。這個信號表示為相對熒光單位，是熱循環儀軟件相對于溫度循環周期數而繪制的（圖3）。

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圖 3. 實時PCR擴增曲線. 畫圖關聯熒光信號與溫度周期數。這個信號是實時測量的，因此可以隨著PCR的進行，實時監測反應的進展。

PCR廣泛應用于科研，臨床和法醫領域。在分子生物學研究中，PCR常用于基因工程，DNA測序，基因表達分析。 在臨床實驗室中，PCR對感染性**的檢測是至關重要的。在司法鑒定中，PCR的應用包括親子鑒定和DNA指紋。這些應用都是利用了PCR極高的敏感性，即使是來自人的一根頭發中靶核酸序列，PCR也能檢測出來。表1列出了PCR的主要應用及其參考文獻。

PCR方法有許多種，每種方法都有各自的優點和局限性。標準或常規PCR是PCR反應的*基本類型。能給出定性結果，并且需要PCR結束后的DNA檢測或觀察步驟。常規PCR的主要優點是成本相當低，并且幾乎所有的實驗室都有可用的常規PCR儀。通常情況下，常規PCR反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳按照核酸片段的大小分離產物。 使用溴化乙錠或Sybr Safe等嵌入染料和紫外線光源觀察DNA擴增產物。 PCR反應特異性的初步確定是通過產物的片段大小相比于DNA梯狀條帶，DNA梯狀條帶是已知大小的DNA片段的混合物。產物的電泳條帶可從凝膠中切割分離，條帶中的DNA通過純化和測序，從而更可靠地確定PCR反應特異性。圖2是瓊脂糖凝膠電泳圖的一個示例，左側是DNA梯狀條帶，右側是幾個PCR反應產物的電泳。標準或常規PCR的局限性是靈敏度低，并且不能給出定量結果。

實時PCR是*近的，但已經非常普遍的PCR方法，與常規PCR相比，實時PCR有幾個優點。首先，可以實時檢測PCR產物，所以就不需要在PCR結束后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測DNA了。此外，實時PCR是定量的和特異的。通過與已知量的DNA的標準曲線相比，可以確定樣本的靶序列起始量。PCR反應之后，通過使用特定的核酸探針和/或熔解曲線分析，使其特異性增加。參見圖4示例的單一的PCR產物的熔解曲線。單峰的存在表明PCR反應得到了單一的擴增產物。多峰的存在表明PCR反應得到了多個擴增產物，由此PCR檢測的反應體系需要進一步優化和改進。實時PCR的局限性是成本增加，并且需要專門的熱循環儀，而且靶核酸序列起始量的定量**度有限。

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圖 4. 熔解曲線圖. 實時PCR使用DNA結合染料檢測之后，通過熔解曲線分析反應產物，以確定是否生成了單一的PCR產物。

PCR芯片是使用實時PCR熱循環儀，基于實時PCR的SYBR green檢測。 PCR芯片是在96孔板各孔中加入不同的基因特異引物，可以檢測同一樣品中多達88個基因的表達，以及8個標準或對照反應。PCR芯片在96孔板的每一個孔中檢測單一基因的特定產物。PCR芯片通常包括對照反應，能給出基因表達的定量結果。PCR芯片通常是用于一個特定的生物學通路（例如，DNA修復，細胞周期，或氧化應激）的一組相關基因的表達分析。PCR芯片的優點是可以同時檢測一個樣品中多個不同基因的表達。局限是每個樣品都需要分別處理，所以非常耗時，而且也很昂貴。

微流控芯片PCR是使用微細加工和微流體，與常規或實時PCR相比，微流控芯片PCR可以更快速地擴增DNA。此外，微流控芯片PCR的體積小，并且集成了檢測元件，所以具有更好的便攜性和便于野外使用。數字和液滴的數字PCR能夠分隔核酸分子，不需要標準曲線就能定量PCR終產物。這樣就可以非常**地測定拷貝數，并且能夠檢測到非常低拷貝數的目標核酸序列。雖然微流控芯片PCR是強大和**的，但是許多研究者都用不起。這是由于所需的微加工設備，或需要購買的預制芯片，是相當昂貴的。然而，微流控芯片PCR發展迅速，成本可能很快就會顯著降低。

生物學研究還使用了許多其他PCR方法。基因分型通常使用等位基因特異的PCR [24] 。表觀遺傳學研究是主要使用甲基化特異的PCR。這種技術檢測基因組DNA中CpG島的甲基化 [25] 。降落PCR（Touchdown PCR）是通過隨著反應的進行，逐步降低退火溫度，從而減少非特異性擴增。這種技術有利于特定靶序列擴增產量的提高 [26] 。

雖然PCR是一種很普及的技術，但是仍有很多機會可以改進，從而縮短反應所需的時間和降低反應液的體積。反應速度取決于加熱和溫度循環機制的類型，以及反應液的體積，因此是PCR改進的首要目標。基于金屬塊加熱的PCR系統，使用間接傳導加熱，是很普及的，但是金屬塊的熱質量很高，并且需要的反應液體積比較大，所以熱變化率相當緩慢(3?C/s) [27] 。Roche Lightcycler使用對流加熱（convective heating），并且需要的反應液體積只有幾微升，所以溫度變化的速度很快(10?C/s) [28] 。 微芯片PCR設備進一步加快了反應的速度和降低了反應液的體積。這些芯片*常用的導熱原材料是硅或玻璃。這些芯片是熱電加熱，通過基于對流加熱的旋轉平臺，或嵌入式電阻加熱器加熱 [29] [30] [31] ，并且需要的反應液體積只有幾微升。微芯片PCR還可以使用鎢絲燈的紅外線輻射直接加熱 [32] 。也可以使用激光器的紅外導直接加熱 [33] [34] 。這兩種方法都能在幾分鐘之內得到PCR結果，并且需要的反應液體積只有幾皮升（picoliters）。

假陽性和假陰性PCR結果都影響PCR檢測的有效性，所以就有必要優化PCR反應，以防止這些假象。假陽性結果是指即使在反應體系中沒有加入起始模板，也能檢測到DNA擴增產物。這可能是由于存在污染。必須在潔凈實驗室操作，以避免氣霧化的DNA不經意地污染反應體系。假陰性結果是指雖然靶核酸是存在的，但是卻無法檢測到擴增產物。原因可能是引物的問題，或者是溫度循環參數不是*優化的，或者是擴增的產物量低于系統的檢測下限。為了減少假陰性的發生，就有必要對PCR檢測的體系設計和溫度循環條件進行優化。這包括選擇高質量的引物 [35] [36] [37] ，循環過程中溫度的優化，使用高質量的核酸模板。

與常規PCR相比，實時PCR有顯著的優點。實時PCR使用檢測系統測量的熒光指示，通常是96孔板的封閉管中的DNA擴增產物。實時PCR不需要在PCR結束之后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，從而顯著縮短了獲得結果所需的時間。 在每個溫度循環后，檢測PCR產物，這樣就可以測量PCR的反應動力學。與通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA相比，PCR產物的熒光檢測也更加敏感，所以靶DNA的兩倍量差異，實時PCR就能夠檢測出來，但是常規PCR和瓊脂糖凝膠就不可能檢測出來。此外，使用基于探針的實時檢測，PCR擴增產物的檢測就是序列特異的。

DNA結合染料: 實時PCR采用與PCR產物相互作用的熒光染料或探針。熒光檢測的兩種主要類型是DNA結合染料，例如SYBR Green，或熒光標記的序列特異探針，例如TaqMan或分子信標探針（Molecular Beacon probes）。當DNA結合染料結合于任何雙鏈DNA片段時，染料就發出熒光信號 [38] 。當只有單鏈核酸存在時，這些染料就不結合于核酸，發出的熒光信號就很弱。雖然SYBR Green是*常用的，但是其他一些DNA結合染料也有使用。這些染料包括SYTO 9, [39] SYTO-13, SYTO-82, [40] 和 EvaGreen [41] 。因為這些染料的熒光信號的檢測不是序列特異的，所以就必須進行熔解溫度分析，以確保PCR產物是單一的產物 [42] 。參見圖4示例的單一的PCR產物的熔解曲線。如果熔解曲線有多個峰，那么就表明存在多個PCR產物，PCR檢測體系就需要進一步優化。雖然這種方法可能是耗時的，但是SYBR Green和其他DNA結合染料仍然很受歡迎，這是因為基于染料的檢測方法在價格成本上明顯低于基于探針的檢測方法。

核酸酶依賴的探針: 實時PCR采用的檢測化學的**種主要類型是序列特異性熒光標記的探針。這些探針系統可以是核酸酶依賴的探針或者是簡單的雜交探針。核酸酶切割的探針包括TaqMan, HybProbe（兩種寡核苷酸），小溝結合（MGB）探針，鎖核酸（LNA）探針。這些探針與PCR擴增產物中的目標核酸序列互補結合，探針的兩端分別共價連接一個報告熒光染料和一個淬滅熒光染料。這些系統使用的是螢光共振能量轉移（FRET）技術。當染料彼此接近的時候，報告染料的熒光信號被淬滅，因此就檢測不到任何信號了。然而，當染料彼此分開的時候，報告染料的熒光不被淬滅，因此就能檢測到信號 [43] 。探針退火結合的序列是在PCR引物的結合位點中，Taq DNA聚合酶在延伸引物產生PCR產物的同時，其5外切酶活性把探針的末端切除。淬滅染料被切除之后，報告染料就能在激發下，產生熒光信號。循環探測技術（CPT）的探針包含RNA核苷酸，所以不同于TaqMan類型的探針。CPT探針雜交于靶序列之后形成RNA-DNA雙鏈。 然后用RNaseH酶把探針的淬滅染料切除 [44] 。

雜交探針: 雖然雜交探針也是序列特異的，但是不需要核酸外切酶把雜交探針的染料切除。雜交探針包括分子信標（Molecular Beacons），在兩個反向重復序列之間有一個單環區域，形成了一個發夾結構。探針變性，然后退火結合到目標序列，發夾就被打開了，熒光染料彼此分開，足以使得報告染料生成增強的熒光信號 [45] 。其他檢測探針技術，包括Scorpion（探針和引物合并在一個分子上 [46] ），LUX (Light Upon eXtension)檢測 [47] 。 Lux 引物的發夾結構淬滅了 Lux 引物探針3端的熒光染料信號。一旦引物結合到靶序列，隨著DNA聚合酶延伸引物序列，染料的熒光信號就增強了 [47] 。

實時PCR熱循環儀系統檢測的熒光強度，與PCR擴增產物的積累是成正比的。然而，結果分析只限于實時PCR反應指數時期的數據，因為這是**定量的*佳數據點。閾值循環數（CT）是實時PCR反應管中的熒光強度超過閾值時溫度循環的周期數，熒光強度的閾值是設定在基線以上，但是在擴增的指數時期之內。實時PCR一般采用兩種定量測定方法。相對定量是把試驗處理的樣本與對照的樣本相比較，比照標準化的內參基因表達量，確定靶序列基因表達量的相對比例。關鍵是試驗處理方法不會對使用的內參基因的表達量造成影響。相對定量的主要優點是因為不需要建立校準曲線，所以縮短了檢測時間。常用的方法包括相對標準曲線法，以及比較CT法(ΔΔCT)。后者的數學模型計算參見 Pfaffl [48] 。

**定量是通過把樣品的擴增信號對比于靶DNA的標準曲線，檢測樣品中靶序列的實際的起始量。校準曲線可以是基于核酸分子（可以是重組質粒DNA其中插入了亞克隆擴增序列，實時PCR產物，或合成的大片段寡核苷酸）的稀釋，。質粒DNA被廣泛使用，是因為它的穩定性高于PCR產物或寡核苷酸。然而，較短模板的準備所需的時間也較短。通過對已知濃度的質粒（插入了亞克隆擴增序列）進行實時PCR，得到質粒的標準曲線，畫圖關聯CT值與靶序列起始拷貝數的對數(Figure 5)。 CT值與起始拷貝數的對數是成反比的 [49] 。通過對標準曲線的線性回歸，確定試驗樣品的靶序列起始拷貝數 [50] 。

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圖 5. 質粒DNA的實時PCR的標準曲線. 質粒pGEMT重組克隆靶基因的擴增序列。經DNA測序證實靶基因擴增序列的存在。一式三份地稀釋質粒，畫圖關聯PCR反應的閾值循環（CT）與質粒DNA已知的起始量。

自1990年以來，對PCR反應和熱循環儀的微型化**，體現在微流控芯片PCR。例如，在1998年，Northrup et. al報道了他們創建的一個微型分析熱循環儀（MATCI），是硅材料的并且反應孔集成了加熱器 [51] 。MATCI儀在PCR循環進行的同時實時檢測熒光信號，儀器在便攜性**同于公文包。此后，微流控芯片PCR領域開始了騰飛，技術進步包括多種加工材料和構造 [52] 。

大多數PCR芯片的反應腔是硅材料的。硅具有優異的導熱性，在溫度循環過程中可以實現快速溫度變化。然而，芯片材料也可以是玻璃，聚合物包括聚碳酸酯和聚二甲基硅氧烷，陶瓷，317不銹鋼。芯片構造可以是基于靜態固定反應腔，也可以是基于動態連續流動的。固定反應腔的芯片，PCR反應液是靜態的，反應腔進行溫度循環。這些芯片可能是單腔或多腔。動態連續流動的芯片，在PCR擴增的溫度循環過程中，樣品被泵驅動通過微通道。這些芯片的樣品流速決定了溫度轉換的時間。 微芯片PCR縮短了檢測時間，試劑消耗低，加熱和冷卻的溫度循環速度快，并且降低了耗電量。 微芯片PCR可能需要下游處理檢測DNA，例如瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳。然而，在芯片上也可能包括DNA檢測方法，例如毛細管電泳，熒光檢測或DNA雜交方法 [29] [53] 。 微芯片PCR技術還在繼續發展，包括芯片檢測系統的集成，以及加工材料和溫度循環方法的優化。

基于微流控腔的數字PCR（cdPCR）方法無需使用標準曲線，就能夠進行核酸的**定量 [54] 。數字cdPCR是樣品被分隔成離散的油包水液滴，液滴中可能沒有任何的靶核酸，或可能有一個或多個拷貝的靶核酸序列。 在PCR擴增之后，檢測靶序列的存在，通過計數陽性液滴在液滴總數中所占的比例，進行濃度計算。 “液滴”數字PCR是***的數字PCR方法。“液滴”數字PCR的液滴分隔數目是數字PCR的25倍，可以非常**地估算靶序列的拷貝數 [55] 。